您好,欢迎访问洛阳莱普生信息科技有限公司官网!

12

May
2018

口蹄疫O型病毒AnSA多肽单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的建立

发布者:李秀梅,王庆云,杨志  来源:莱普生科技  浏览次数:103

口蹄疫O型病毒AnSA多肽单克隆抗体的制备及竞争ELISA抗体检测方法的建立

李秀梅1,王庆云2,杨志1
 

(1.洛阳莱普生信息科技有限公司  河南 洛阳,471000;2.安阳市动物疫病预防控制中心 河南 安阳 455000)
 

   摘要:本文针对现有的口蹄疫O型病毒AnSA合成多肽制备单克隆抗体,并建立竞争ELISA检测口蹄疫O型病毒抗体的方法。用已知纯化的AnSA合成多肽偶联物免疫BALB/c小鼠,再将免疫小鼠的脾细胞和生长对数期的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,采用iELISA方法和有限稀释法筛选纯化阳性杂交瘤细胞,最后采用ELISA方法评价免疫小鼠腹水的效价,筛得4株杂交瘤细胞腹水效价在1∶51200以上;采用改良的过碘酸钠法制备酶标单抗。用已知纯化的口蹄疫O型病毒AnSA合成多肽偶联物作为抗原和其对应的酶标单抗建立竞争ELISA方法来检测口蹄疫O型病毒抗体,并对其特异性、敏感性和重复性进行验证。实验数据显示该方法特异性为100%,敏感性为95%,批间变异系数<10%,具有应用前景。通过大量样本进行临床测试,得出该方法检测样本阳性符合率率达到87.65%,可用于评价疫苗免疫后整个动物群中保护性抗体的水平。
   关键词:口蹄疫O型病毒;AnSA多肽;竞争ELISA;单克隆抗体

   Abstract 
The study aimed to synthetize peptides of existing foot-and-mouth disease virus(FMDV) type O AnSA to generate polyclonal antibodies, and established a competitive ELISA method to detect the antibody of FMDV type O. We mithridatized Balb/c mice with the synthetic peptides conjugate AnSA and fused splenocytes from immunized mice with myeloma cells SP2/0 on logarithmic phase. Then, we evaluated the titer of immunized mice ascites with ELISA and used the ELISA with limiting dilution methods to elect and purify the positive hybridoma cells. Four hybridoma cell lines were elected and the titer were above 1∶51200. The HRP-McAb was prepared by modified NaIO 4 method. The antibody of FMDV type O was detected by mean of competitive ELISA and the specificity, sensibility and repeatability were validated. The results showed that the specificity was 100%, sensibility was 95% and the coefficient variance was less than 10%. A large number of samples were tested by clinical testing and the results showed 87.65% positive detection rate. This method can evaluate the level of protective antibody after mithridatized by vaccine.in the fauna.
   Key words: FMDV type O; polypeptide AnSA; competitive ELISA; monoclonal antibody

 

       口蹄疫(Foot and mouth disease)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)引起的一种偶蹄动物共患的急性、烈性、高度传染性疫病,被世界卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为A类动物疫病,我国政府也将其列为一类传染病之首[1]。该病毒共有七个血清型:O、A、C、Asia-I、SAT1、SAT2和SAT3型,其中O型流行最为广泛。及时评价口蹄疫疫苗的免疫保护效果和发现犯病动物是防控的关键。
       由于很多疾病的临床症状相似,单从临床诊断很难确诊,必须配合实验室诊断进行。口蹄疫的实验室诊断大致分为三大类:一是生物学实验,主要是病毒的分离鉴定,包括动物实验和细胞培养;二是血清学诊断,包括补体结合试验、间接夹心ELISA、病毒中和试验、血凝试验、免疫扩散试验、液相阻断ELISA和竞争ELISA等;三是分子生物学诊断技术,包括普通PCR、实时荧光定量PCR技术和基因芯片技[2]
       目前OIE推荐的方法有病毒中和试验(VNT)和液相阻断ELISA(LPB-ELISA),病毒中和试验是比较经典的方法,但因为费时费力,不适合大规模应用。液相阻断ELISA相比较而言结果准确,但由于操作步骤复杂,时间长,给用户带来很多不便。
       本文旨在建立检测动物血清中口蹄疫O型病毒保护性抗体水平的一种方便快捷、准确的竞争ELISA方法。首先根据口蹄疫O型病毒VP1上AnSA位点,设计并人工合成多肽,然后以多肽为抗原筛选出高灵敏度和特异性的单克隆抗体,进而建立一种竞争ELISA检测口蹄疫O型病毒抗体的方法。通过病毒中和实验比对,得出该方法检测阳性样本符合率可达到87.65%;与兰研所的液相阻断ELISA检测试剂盒对比,符合率达到92%;与进口同类试剂盒对比,符合率达到82%,具有良好的应用前景。

1.主要材料与方法

1.1主要仪器与试剂

   酶标仪(BIORAD,ImarkTM),洗板机(北京拓普分析仪器有限责任公司,DEM-3型),电子天平(奥豪斯仪器有限公司,AR224CN),恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限责任公司,81-2型),涡旋仪(赛默飞世尔科技有限公司),酶标板为美国Costar96孔高吸附性酶标板。

口蹄疫O型病毒AnSA多肽,由生工生物工程(上海)有限公司合成、鉴定;SP2/0多发性骨髓瘤细胞由本公司实验室保存;6-8周龄雌性Balb/c小鼠购于河南省实验动物中心;完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、辣根过氧化物酶(HRP)、过碘酸钠和8-杂氮鸟嘌呤购于Sigma公司;口蹄疫O型灭活疫苗购于新疆天康;AnSA多肽-OVA、AnSA多肽-KLH有本公司实验室制备。
   口蹄疫标准阴、阳性血清购自兰州兽医研究所,口蹄疫阴性血清500份采自无FMD病史,未注射过FMD疫苗内蒙古非疫区黄牛,500份采自无FMD病史,未注射过FMD疫苗的河南非疫区育肥猪,并经过液相阻断ELISA检测确定没有爆发过口蹄疫,10份阴性猪血清猪水泡病阳性,但口蹄疫确诊为阴性,10份阴性猪血清水泡型口炎阳性,但口蹄疫确诊阴性,10份牛阴性血清Asia-I阳性,O型确诊为阴性,10份牛阴性血清A型确诊为阳性,O型阴性。口蹄疫O型阳性参考血清200份来自已确定单一口蹄疫O型病毒株感染的康复猪21-28天血清和200份口蹄疫O型疫苗免疫三次后15-28天猪血清,20份人工感染口蹄疫O型猪血清。

1.2单克隆抗体的制备

       将口蹄疫O型灭活疫苗破乳制备口蹄疫O型灭活病毒,经蔗糖梯度离心法获得146s病毒抗原。用口蹄疫O型灭活病毒和偶联抗原AnSA多肽-KLH,按照A,Sanyal等[3]免疫方法对8只小鼠进行免疫,在融合的前3天用双倍剂量的AnSA多肽-KLH(不加佐剂)进行冲击免疫。然后采用间接ELISA测定血清效价,效价达标后即可取脾,按照常规方法进行细胞融合。
取对数生长期的SP2/0细胞与免疫的脾脏细胞以1:10比例在PEG1500作用下融合, 10天后包被AnSA多肽-OVA,采用iELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法将阳性孔细胞进行4次克隆纯化,最后将筛选到的杂交瘤细胞腹腔注射BALB/c小鼠,制备腹水。腹水的单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法纯化。

1.3酶标单抗的制备及抗原包被浓度和酶标抗体浓度的确定

       用改良的过碘酸钠法,制备酶标单抗。用棋盘滴定法确定酶标单抗的最佳工作浓度和AnSA多肽-OVA的最佳包被浓度。

1.4竞争ELISA方法的反应体系

       用碳酸盐缓冲液(pH9.6,0.01M)将AnSA多肽-OVA稀释到最适包被浓度,按照100ul/孔的量加入酶标板,留置调零孔,2-8℃过夜(16-24h)。用PBST洗涤两次,拍干;每孔加200ul封闭液,37℃封闭1个小时,洗涤,干燥。将稀释20倍的待检血清取50μL加入孔内,设阴阳性对照各2孔,立即加入50μL酶结合物,37℃条件下孵育30min(±1min)。洗涤5次后,加入100μL显色液(显色液A、B等比例混匀),37℃孵育15min,加入50μL终止液,用酶标仪测OD450值并计算血清抑制率。

1.5阴阳性临界值的确定

       用竞争ELISA方法对150份口蹄疫O型阴性牛血清样品和150份口蹄疫O型阴性猪血清样品进行OD450nm值的测定,计算血清的PI值,根据阴阳血清抑制率分布确定阴阳性临界值。

1.6特异性试验

       用竞争ELISA方法分别检测水泡病阳性、水泡型口炎阳性、Asia-I阳性和A型阳性猪血清各10份,口蹄疫O型阴性猪血清500份,口蹄疫O型阴性牛血清500份,测定血清的PI值。

1.7敏感性试验

       用竞争ELISA方法测定200份口蹄疫O型病毒灭活疫苗免疫猪血清、200份康复猪血清和10份口蹄疫O型病毒感染猪血清,并用10份口蹄疫O型病毒强阳性猪血清,10份口蹄疫O型病毒弱阳性猪血清,测定血清的PI值。

1.8 重复性试验

       包被3批酶标板,重复检测阴、阳性猪血清各10份,计算批间变异,同时对1份阴性血清重复测定20次,计算批内变异。

1.9临床试验

       用竞争ELISA方法检测新疆、内蒙、黑龙江、山东、四川、河南等省猪场送检的血清样本2000份,计算阳性检出率。

2 结果与分析

2.1单克隆抗体效价和反应性的测定

       用AnSA多肽-OVA 2ug/ml包被酶标板,四免后7天对8只Balb/c小鼠断尾采血用间接ELISA法进行检测,结果显示,所有小鼠抗体效价在1:6400~1:51200之间,且2号、3号小鼠血清抗体效价最高。
细胞融合后用间接ELISA进行筛选,最终筛选出4株能稳定分泌抗口蹄疫O型AnSA多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为#O3A2、#O4C7、#O6E5和#O8D4。
       用已建立的间接ELISA方法,对收集的细胞培养上清、腹水上清及纯化后的抗体进行检测。结果显示(表1),四株单抗的腹水效价最高,纯化后抗体效价次之,细胞培养上清效价最低。

 

表1 单抗的效价测定结果
 


细胞培养上清腹水纯化后抗体
#O3A2
#O4C7
#O6E5
#O8D4
1:800
1:1600
1:1600
1:3200
1:51200
1:102400
1:102400
1:150000
1:25600
1:51200
1:102400
1:100000

2.2  最适工作浓度的确定

       用AnSA多肽-OVA 与单抗-HRP进行间接ELISA检测,选择OD值在1.5左右的抗原、抗体最大稀释倍数为最适浓度,结果(表2)表明AnSA多肽-OVA最佳包被浓度为1:1600,单抗-HRP的最佳稀释浓度为1:16000。

 

表2 免疫小鼠抗体效价的测定
 

 

酶标抗体
稀释倍数
抗原稀释倍数
10020040080016003200640012800
1:10003.4893.4573.1862.8742.4762.0881.7871.478
1:20003.4773.3592.7842.5412.3061.9721.6081.209
1:40003.4193.2682.5012.2742.1981.7041.4761.072
1:80003.3572.9092.2472.0451.7481.4651.1840.897
1:160003.1042.3732.0791.7931.5641.3091.0270.791
1:320002.9442.3731.8441.6511.3861.0420.8530.504
1:640002.6852.0911.5881.4081.1730.8910.6420.422
1:1280002.5071.7471.3251.0870.7130.5020.3240.324
阴性对照0.1420.1770.1840.1960.1650.1720.1880.167
空白对照0.0580.0470.0650.0770.0820.0560.0430.051

 

2.3  阴阳性临界值的确定

       将300份已确定为阴性标本的牛血清和猪血清样本,稀释40倍进行试验,统计每份血清的PI值,按照公式( +3SD)最终确定区分阴阳性血清的PI值为40%。如果PI值<0.4,样品应判定为抗体阴性。如果PI值≥0.4,样品应判定为抗体阳性。以PI值40%定为临界值,阴阳性结果区分明显,差异大于10%。

2.4 特异性试验

       猪水泡病阳性血清、猪水泡型口炎阳性血清、Asia-I阳性血清、A型血清各10份,
口蹄疫O型病毒阴性猪血清500份,口蹄疫O型阴性牛血清500份,用竞争ELISA检测PI值均在0.4以下,检测结果为阴性。

 


不同性质的血清特异性检测结果
 

血清类型血清数/份阴性数/份特异性(%)
水泡病毒阳性猪血清1010100
水泡型口炎阳性猪血清1010100
Asia-I型阳性猪血清1010100
A型阳性猪血清1010100
阴性猪血清500500100
阴性牛血清500500100

2.5  敏感性试验

       用200份口蹄疫O型疫苗免疫猪血清、200份感染后康复猪血清和10份口蹄疫O病毒正在感染猪血清,10份口蹄疫O型病毒强阳性猪血清,10份口蹄疫O型病毒弱阳性猪血清,用竞争ELISA法测定血清的PI值,总阳性符合率为95%。结果见下表5。

 

5不同性质的血清敏感性检测结果
 

血清类型血清数/份阴性数/份阳性数/份敏感性(%)
疫苗免疫猪血清200219899
康复猪血清200619497
带毒猪血清101990
强阳性猪血清10010100
弱阳性猪血清102880

2.6  重复性试验

       用竞争ELISA法对10份阴性血清和10份阳性血清,独立重复检测三次,计算批间变异系数为9.6%,将1份阴性血清重复20次计算批内变异系数为6.2%。

2.7临床试验

       用竞争ELISA法检测了分别来自新疆,内蒙,黑龙江,山东,四川,河南等省猪场送检血清样本2000份,通过计算其PI值,测得其中阴性样本247份,阳性样本1753份,阴性率12.35%,阳性率为87.65%。

3 讨论与结论

       近几年固相阻断ELISA检测试剂盒发展迅猛,因其操作简便、耗时短广受欢迎。目前,固相阻断ELISA检测试剂盒以进口为主,国产较少[5]。本研究建立一种直接竞争ELISA检测方法,其操作时间短,方便快捷,仅需1个小时即可完成实验。其敏感性和特异性与VNT、LPB-ELISA相比较,结果高度相关,符合率能达到90%左右,与进口的同类产品比较符合率>85%。
       本方法的关键是选择合适的抗原表位,制备出高特异性和高亲和力的单克隆抗体。FMDV抗原变异频繁,各亚型之间的抗原差异性很大,因此必需选择高度保守的抗原位点。VP1蛋白暴露在FMD病毒粒子的表面,是诱导产生中和抗体的主要成分,其中140~160(G-H环)和200~213位的肽段是产生中和抗体的关键抗原表位[6][7]。敏感性、特异性和精密度是检验ELISA试剂盒的重要指标,直接关系到检测的准确性。本研究建立了一种特异性强、敏感性高、方便快捷、可靠实用、稳定性好的竞争ELISA方法。该方法大规模应用后,将极大地减轻检测人员的工作负担,且操作简便,有助于向基层推广,将为口蹄疫的检测和诊断发挥重要作用。

参考文献

[1] 谢庆阁,口蹄疫[M],北京:中国农业出版社,2004.
[2] 宁宜宝,王明俊.我国兽用生物制品技术的发展历程与展望[J],《中国兽药杂志》,2002(08):16-19.
[2] Sanger D V,The replication of picornavirus,J Gen Virol,1979,45:1~13.
[3] Sanyal A, Venkataramanan R, Pattnaik B. Antigenic features of foot and nouth disease viruser O type Asial as revealed by monoclonal antibodies and neutralization escape mutants. Virus Res, 1997, 4: 168-173.
[5] 高艳春,赵德明.我国兽用生物制品行业现状分析及发展建议[J].产业透视,2011,47(2):55-59.
[6] P.Zamorano,A  10-Amino-Acid Linear Sequence of VP1 of Foot and Mouth Disease Virus Containing B-andT-Cell Epitopes Induces Protection inMice Virology,1995,212:614~621.
[7] Ruben Marrero,A computational study of the interaction of the foot and mouth disease virus VP1 with monoclonal antibodies,Journal of Immunological Methods,2015,12052:1~7.


上一篇:已经没有了

下一篇:RFID技术在畜牧信息化管理中的发展

视频中心

更多有关视频

全国热线

生物检测诊断:
0379-69970661

动物溯源标识:
0379-65619191

扫码关注
莱普生官网微信